Uma equipe de pesquisadoras do Laboratório de Bacteriologia e do Centro de Desenvolvimento de Anticorpos do Butantan desenvolveu dois testes rápidos para diagnóstico de leptospirose, um de detecção pela urina e outro pelo sangue. Ambos os testes oferecem resultados em até 25 minutos, enquanto nos testes padrão o resultado confirmatório da doença pode demorar dias. As duas pesquisas já têm patentes concedidas pelo Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI), órgão atrelado ao Ministério do Desenvolvimento, Indústria, Comércio e Serviços do Governo Federal.
Cada teste permite detectar a doença em momentos distintos – o primeiro, pela urina, no início da infecção; o segundo, pelo sangue, quando a bactéria já se espalhou. Isso pode ser determinante no acesso mais ágil ou em tempo hábil ao tratamento, levando em conta que a leptospirose pode causar a morte em até 40% dos casos graves, segundo o Ministério da Saúde.
Atualmente, o diagnóstico da doença é feito somente em laboratórios de referência e depende de cultura bacteriana, com resultado que pode demorar de 15 a 30 dias para ser conclusivo. A demora decorre da necessidade de análise de uma segunda amostra de sangue do paciente.
Os testes rápidos permitem obter um resultado entre 20 e 25 minutos. O feito com urina usa o método de quimioluminescência (emissão de luz durante uma reação química) e o com sangue é uma análise imunocromatográfica (identificação da doença por associação a anticorpos), semelhante ao teste rápido de Covid-19.
“O diagnóstico da leptospirose é complexo do ponto de vista clínico porque os sintomas se confundem com doenças febris como malária, dengue e febre amarela, entre outras. Se tivermos um teste rápido, simples e eficiente, conseguimos tratar principalmente os que evoluem de forma grave”, afirma a pesquisadora científica, atualmente do Núcleo de Produção de Vacinas Bacterianas do Butantan, Patricia Aniz, que coordenou o desenvolvimento dos dois testes.
Vantagens dos testes rápidos
Diante das dificuldades em se obter resultados laboratoriais precisos e da apresentação clínica inespecífica da leptospirose, as equipes do Laboratório de Bacteriologia e do Centro de Desenvolvimento de Anticorpos do Butantan entenderam ser cada vez mais necessário trabalhar no desenvolvimento de métodos mais simples e eficientes.
“O objetivo das pesquisas foi resolver os problemas constantes que envolvem o diagnóstico de leptospirose a partir do desenvolvimento de dois testes mais rápidos, sensíveis e específicos que possibilitem um resultado confirmatório e definitivo, contribuindo na escolha correta do tratamento da leptospirose”, afirma Patricia.
Teste imunocromatográfico
A análise imunocromatográfica é uma velha conhecida dos cientistas, já que a tecnologia é usada em testes de detecção de anticorpos de Covid-19, entre outras doenças. O teste desenvolvido no Butantan parte da pesquisa de doutorado da estudante Tatiana Barrinuevo Gotti, desenvolvida no Laboratório de Bacteriologia em colaboração com a pesquisadora Roxane Maria Fontes Piazza, coordenadora do Centro de Desenvolvimento de Anticorpos do Instituto Butantan e com a pesquisadora Letícia Barboza Rocha. A patente do teste foi solicitada em 6 de setembro de 2016 e concedida em 17 de dezembro de 2024.
“Para o desenvolvimento do método foram selecionadas 11 proteínas da membrana externa da leptospira como candidatos a antígenos, com uma apresentando reatividade. Estas proteínas foram clonadas, expressas e purificadas, sendo testadas em ensaios do tipo Elisa e western-blot [teste de identificação de proteínas específicas]. Depois essa proteína reativa foi ligada ao ouro coloidal [que é o que deixa a cor da linha avermelhada] e também inoculada em animais para a produção de anticorpos específicos”, esclarece Patricia.
No teste desenvolvido pelo Butantan, a amostra de soro obtida do sangue do paciente é adicionada a uma fita de membranas de nitrocelulose e papel absorvente, que entra em contato com reagentes e com os anticorpos contra a leptospira. A detecção da ligação do anticorpo com a proteína da leptospira (antígeno) oferece um resultado em até 20 minutos. Se duas linhas (linha teste e linha controle) aparecerem avermelhadas, o resultado é positivo; se aparecer só uma linha (controle) vermelha, o resultado é negativo.
O trabalho de Tatiana, Letícia, Roxane e Patrícia foi vencedor do Prêmio de Inovação (Butantan – IPLYMPICS) na 17a Reunião Científica Anual do Instituto, realizada em dezembro de 2015.
Segundo Patricia, o método traz uma série de vantagens, sendo a principal a rapidez no resultado e a facilidade de execução. “O resultado está disponível em poucos minutos, permitindo uma resposta rápida e um manejo mais eficaz da doença. Além disso, a simplicidade de aplicação contribui para uma maior acessibilidade, além do fato de o teste ter uma sensibilidade adequada e um baixo custo”, finaliza.
Teste por quimioluminescência
Anos antes da pesquisa de Tatiana e Letícia, a então doutoranda Larissa do Rêgo Barros Mato, com colaboração do pesquisador Luiz Bezerra de Carvalho Júnior, da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), e sob orientação de Patrícia, desenvolveu outro teste diagnóstico para a leptospirose no Laboratório de Bacteriologia, complementar ao teste imunocromatográfico.
O método desenvolvido para o diagnóstico da leptospirose é baseado em um anticorpo ligado a um composto quimioluminescente para detecção de leptospiras na urina. A reação entre o anticorpo e o antígeno (a leptospira) é detectada pela emissão de luz. A patente foi solicitada em 14 de maio de 2014 e concedida em 3 de novembro de 2021.
O método já é utilizado no diagnóstico de doenças infecciosas, dosagens hormonais (como teste de gravidez) e detecção de biomarcadores devido a sua alta sensibilidade e rapidez, o que permite a detecção de substâncias em concentrações muito baixas.
Ele funciona da seguinte forma: a amostra de urina é colocada em contato com o anticorpo ligado a um composto quimioluminescente por 15 minutos em temperatura ambiente; depois é centrifugada por 5 minutos e o sedimento é ressuspendido em solução salina, à qual são adicionados dois reagentes (A e B). A emissão de luz, que é avaliada por um aparelho chamado luminômetro, capaz de medir as unidades relativas de luz (RLU), ocorre em segundos. A amostra é considerada positiva para a presença de leptospiras se o valor de RLUs for maior que o limite de detecção.
“A principal vantagem deste método é permitir o diagnóstico precoce e rápido da leptospirose, uma vez que detecta a bactéria na fase inicial da doença, antes da produção de anticorpos”, conta Patricia. “Além disso, é um procedimento simples e de baixo custo, de execução em até 25 minutos, sem reatividade com outras bactérias presentes na urina ou que causam infecções em pessoas e animais”, ressalta a pesquisadora.
O Butantan mantém outras pesquisas ligadas à criação de novos métodos diagnósticos para leptospirose. Uma delas, realizada pelo Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, desenvolveu uma proteína quimérica para o diagnóstico da leptospirose que se mostrou superior ao teste padrão atualmente recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS).
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